發(fā)布時間：2020/6/2 15:41:05 閱讀次數(shù)：1914
前兩周的“Western Blot 常見問題分析”中,我們主要分享了一些異常的實驗結(jié)果,今天我們來講講關(guān)于Western Blot實驗可能會存在的疑惑.話不多說,直接上貨：
不一定,因為有的抗體是識別線性表位的,有的是識別構(gòu)象型表位,識別構(gòu)象型表位的抗體不能用于Western blot,因為在Western blot中抗體識別的是完全變性的蛋白質(zhì)抗原,而蛋白質(zhì)抗原的構(gòu)象型表位變性時被破壞.
不要同時加兩種一抗,因為如果結(jié)果里面有非特異性信號的話,就說不清楚.做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內(nèi)對照,也是先上目的蛋白的一抗 二抗 ECL顯色 壓片 洗片,漂洗后加內(nèi)對照的一抗 二抗 ECL顯色 壓片,洗片.
做Western來講,理論上單抗比多抗的特異性要好但價格偏高,一般來說多抗就OK了.用于Western的抗體和用于ELISA的抗體,一般來說用于Western的抗體識別的是氨基酸序列特異性,而可用于ELISA的抗體要看抗原種類,有些是識別氨基酸序列特異性,有些是識別構(gòu)象特異性,所以一般根據(jù)說明書來確定.做免疫印跡選擇抗體主要考慮兩個問題,一是所選抗體是否識別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白,另一個是所選抗體是否會引起交叉反應(yīng)條帶.
可以相等,但是如果濾紙 膜比凝膠大就比較容易形成短路了,上下兩層濾紙也不能因過大而相互接觸,這樣會短路,電流不會通過膠和濾紙.轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過程中看看電壓就行,正常的半干轉(zhuǎn)是慢慢變高的,結(jié)束時一般是開始的1.5-3倍都是正常的.
大分子量蛋白傾向于在膠里沉淀,阻礙轉(zhuǎn)移.可以考慮：在轉(zhuǎn)膜緩沖液里加入終濃度0.1%的SDS有助于增加轉(zhuǎn)移效率；轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇,甲醇可以降低蛋白質(zhì)洗脫效率,增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力,防止凝膠變形,延長大分子量蛋白轉(zhuǎn)移時間；用4℃濕轉(zhuǎn)過夜代替半干法轉(zhuǎn)膜.
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